Культуры клеток беспозвоночных в решении биотехнологических и ветеринарных проблем пчеловодства

Российская коллекция клеточных культур (РККК), созданная в 1978 году, объединяет восемь специализированных коллекций. Специализированная коллекция постоянных линий клеток беспозвоночных ВИЭВ РАСХН содержит клеточные линии насекомых, используемых для исследований в области генетики соматических клеток, вирусологии, микробиологии и криобиологии.

Разработка криобиологических технологий необходима для сохранения гамет, соматических клеток и целых эмбрионов в целях поддержания биоразнообразия редких и исчезающих видов, а также уникальных генетически чистых линий насекомых.

 В нашем криобанке содержатся основные представители из мировой коллекции культур клеток насекомых и сперма трутней медоносной пчелы, сохранявшей после 20 лет криоконсервации при -196оС основные генетические параметры и оплодотворяющую активность: при искусственном осеменении пчелиных маток дефростированной спермой в 70%-99% случаев получаются полноценные рабочие пчелы. В наш криобанк включены также сперма амурского тигра, дальневосточного леопарда, канадского журавля, эмбрионы дрозофилы Drosophila melanogaster Oregon R и аквариумной рыбки Danio rerio.

Постоянные линии клеток получены от представителей различных отрядов насекомых, однако большинство из них всего от двух отрядов: двукрылых (Diptera) и чешуекрылых (Lepidoptera). Наличие постоянных линий клеток беспозвоночных позволяет получать большое количество одинаковых по геному клеток, доступных для экспериментального воздействия.

Такие клетки необходимы при изучении индуцибельной экспрессии генов, так как экспериментальные воздействия на культивируемые клетки не маскируются гормональной и нервной регуляцией целого организма. Совершенно незаменимы клеточные культуры беспозвоночных в исследованиях патогенных вирусов и внутриклеточных паразитов, имеющих большое значение для контроля численности насекомых и изучении мобильных генетических элементов в популяциях при изменении экологических условий [1].

В настоящее время все постоянные линии двукрылых и чешуекрылых активно растут в разработанной нами среде С46 — среде Какпакова, с добавлением сыворотки или без неё. К среде Какпакова С46 [2] нам удалось адаптировать широко используемые в мире постоянные линии клеток дрозофилы Drosophila melanogaster, Drosophila virilis, Drosophila hydei, тутового шелкопряда Bombyx mori, комаров, шинельной моли Spodoptera frugiperda.

В ходе 40-летних систематических наблюдений над линией клеток дрозофилы 67j25 D, выдержавшей 2400 пересевов (пассажей) или около 10800 клеточных генераций были выявлены закономерности кариотипической изменчивости в период становления и стабилизации постоянных клеточных линий дрозофилы, поддерживаемых в стандартных условиях культивирования.

Линия клеток дрозофилы 67j25 D используется для изучения количества и качества гормонов членистоногих и ракообразных. При добавлении в среду с культурой клеток гормона линьки экдистерона в дозе 0,0001 мкг/мл (10-10 г) слабо стимулирует рост клеток. Доза в 0.001 мкг/мл (10-9 г) на 10-30% повышает коэффициент пролиферации клеток. Доза 0.01 мкг/мл (10-8 г) задерживает рост клеток на 50-69%, а доза 0.1-1 мкг/мл (10-6 г) останавливает рост клеток.

Выделенные новые клеточные линии и первичные культуры слюнных желез дрозофилы являются прекрасной тест-системой для разработки и использования принципов бионанотехнологии при создании профилактических и лекарственных препаратов для оздоровления пчелиных семей. На краткосрочной культуре слюнных желез дрозофилы в питательной среде С50 определенная доза гормона в мкг/мл вызывает синтез информационной РНК на политенной хромосоме, которые хорошо видны в виде рыхлых вздутий (пуффов). У Drosophila melanogaster выявлены пять пуфов, индуцируемых гормоном линьки экдистероном: 63F, 71CE, 72CD, 82 EF и 83E и четыре пуфа специфически активируемых ювенильным гормоном: 43E, 58DE, 60B, 85D [3,4]. Эти тесты послужили для создания и определения срока годности профилактического и лекарственного препарата ВЭСП, который служит для оздоровления и повышения продуктивности пчел [5].

Постоянные линии клеток шинельной моли Spodoptera frungiperda и тутового шелкопряда Bombyx mori и озимой совки Agrothis segetum, адаптированные к среде С46, являются базой для развития инновационной клеточной биотехнологии с целью получения вирусных инсектицидов и генно-инженерных биопродуктов для ветеринарной медицины.

Таким образом, специализированная коллекция постоянных линий клеток беспозвоночных животных ВИЭВ им. Я. Р. Коваленко содержит клеточные линии насекомых, которые используются в исследованиях генетики и молекулярной бииологии насекомых, в создании новых профилактических и лекарственных препаратов для пчел, а также как тест-системы для выявления качества питательных сред и продуктов пчеловодства (экологический апимониторинг).

Литература

• Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М. Наука, 1984, 472с.
• Echalier G. Drosophila cells in culture. AP, 1997, 702 p.
• Патент Украины на полезную модель №27010 от 10.10.2007. Бюл. № 16
• Патент Украины на полезную модель №27011 от 10.10.2007. Бюл. № 16
• Полуэктова Е.В., Митрофанов В.Г., Какпаков В.Т. Действие гормонов насекомых на пуффинг хромосом слюнных желез Drosophila virilis Sturt., культивируемых in vitro. Сообщение 1. Изменение пуффинга при культивировании желез в среде С50. // Онтогенез 1980, 11 (2): 175-180

Сайфутдинова З.Н., Какпаков В.Т. ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко РАСХН, г. Москва