Дифференциация отечественных пород пчел по микросателлитным локусам

На территории России в настоящее время распространены популяции темной лесной пчелы A. m. mellifera, к которой относится среднерусская порода (1). Разводят также пчел карпатской и серой горной пород, а также специально выведенные гибридные породы, например, гибрид среднерусская/серая горная – «Приокский» породный тип. Эти породы пчел входят в Государственный реестр пород, допущенных к разведению в России как обладающие высоким генетическим потенциалом продуктивности и биологическими особенностями. В последние десятилетия популяции среднерусской пчелы подвергались стихийной и бесконтрольной гибридизации. В России на ряде территорий произошла гибридизация среднерусской породы с южными подвидами A. m. carnica, A. m. liguistica и A. m. caucasica. Для центральных районов Пермского края с высоким уровнем урбанизации актуален вопрос гибридизации среднерусской породы пчел с карпатской A. m. carpatica, так как пчеловоды предпочитают более миролюбивую карпатскую пчелу агрессивной темной лесной (2). На Южном Урале основной проблемой в разведении и селекции пчелы A. m. mellifera является ее метизация с кавказской пчелой A. m. сaucasica (3).

В данной работе мы предлагаем метод анализа ядерной ДНК пчел по микросателлитным локусам, который, в дополнение к генотипированию пород по мтДНК и морфометрическому методу (4), позволяет дифференцировать популяции, а также проводить анализ семей пчел на предмет принадлежности к определенной породе (5).

Материал для исследования собран в 2009 году. Для анализа использованы рабочие пчелы отечественной селекции из шести популяций наиболее распространенных пород России: М – выборка пчел Федерального государственного унитарного предприятия племенного хозяйства «Майкопское» Республики Адыгея, карпатская порода (N=40), SR – выборки пчел среднерусской породы: Владимирская область, Собинский район (N=17), и Научно-производственного центра по селекции пчел «Татарский», Мамадышский район) (N=17), SG – выборка пчел Краснополянской опытной станции пчеловодства Краснодарского края, п. Краснополянский, (SG, N=40), SG/SR – выборка пчел гибридного породного типа «Приокский», Рязанская область с. Бортники (N=9). При формировании выборок для анализа мы выбирали случайным образом по 4 пчелы из каждой семьи в выборке К, по 2 пчелы из 3х семей и по 3 пчелы из 4х семей в выборке SR, в других выборках  по одной пчеле из семьи.

ДНК пчел выделяли при помощи набора ДНК Diatom DNA prep 400 (Изоген, Россия). Постановку реакции ПЦР осуществляли при помощи набора GenePack PCR Core (Изоген, Россия). Амплификацию ядерной ДНК пчел проводили по микросателлитным локусам A14, A24, A28 и A88 (6). Результаты ПЦР визуализировали в акриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием.

Проведенный анализ выявил полиморфность всех МС локусов у изучаемых пород пчел. Наибольшее генетическое разнообразие установлено для пчел карпатской породы (K), у которых среднее число аллелей на локус составило 5,00, у остальных пород – 3,75. Наибольшее число эффективных аллелей – 2,52 выявлено у породного типа SR/SG, и несколько меньшее у SR – 2,31 и наименьшее для К - 2,02. Детальный анализ локусов показал высокую информативность выбранных 4-х МС локусов. Минимальное число аллелей в одном локусе у пчел различного происхождения составило 3, а максимальное – 7 (K).

Другой характеристикой пород является присутствие породоспецифичных аллелей, т.е. аллелей, встречающихся только в одной из них. Чем больше породоспецифичных аллелей в породе, тем вероятно более изолированной она является. Наибольшее число породоспецифичных аллелей - 7 - установлено у пчел (K). У пчел SR обнаружено 3 приватных аллеля, а у пчел SG – один (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика полиморфизма четырех микросателлитных локусов у различных пород пчел

Во всех исследованных породах медоносной пчелы выявлен дефицит гетерозигот (табл. 1).

С помощью параметра Fit установлен высокий уровень инбридинга - 34,1%  в исследованных породах пчел. Среднее значение Fst по 4 локусам для всех пород равнялось 0,184. При вычислении коэффициента Fst при попарном сравнении пород выявлено, что наибольшее различие наблюдается между выборками К и SR (Fst=0,225), а наименьшее между SG и SR/SG (Fst=0,032).

Нами была проведена оценка генетической консолидированности исследуемых популяций пчел при помощи анализа генетического разнообразия AMOVA. При анализе степени идентификации пород выявлено, что наиболее четко дифференцированы выборки K и SR (Fst=0,225), ближе всего генофонды SG и SR к SR/SG (Fst=0,032 и 0,174, соответственно). Также определено, что наименьшие различия установлены для выборок К и SG, что, отчасти обусловлено их близким географическим местоположением и, вероятно, свидетельствует о проникновении возможных взаимных потоков генов в местах одновременного разведения или разведения на смежных территориях. Степень дифференциации между породами указана в табл. 2.

Таблица 2. Оценка генетической дифференциации отдельных пород пчел

Для всех исследованных выборок наблюдали отклонение от равновесия Харди-Вайнберга по ряду локусов, что обусловлено спецификой формирования выборок. Для выявления генеалогических связей между породами произвели расчет генетических расстояний. Генетические расстояния между исследуемыми породами пчел, рассчитанные по методу М. Нея (7), представлены в табл. 3.

Таблица 3. Матрица генетических расстояний для изученных выборок по методу М.Нея (7)

Наибольшей генетической удаленностью от других исследованных пород характеризуется SR. Породы K и SG более близки друг к другу, что проявляется в формировании ими единого кластера на генетическом древе. Вероятно, это обусловлено их присутствием на одних и тех же территориях. Также генетически близки и SG и SR/SG, что соответствует происхождению последних.

Литература

• Кривцов, Н. И. Среднерусские пчелы. СПб.: Ленинград, 1995. С.1-123.
• Кривцов Н.И., Сокольский С.С., Любимов Е.М. Серые горные кавказские пчелы. Сочи, 2009. C. 1-192.
• Никоноров Ю.М., Беньковская Г.В., Поскряков А.В., Николенко А.Г., Вахитов В.А. Использование метода ПЦР для контроля чистопородности пчелосемей Apis mellifera mellifera L. в условиях Южного Урала // Генетика. 1998. № 11. С. 1574-1577.
• Кривцов Н.И., Горячева И.И., Удина И.Г., Бородачев А.В., Монахова М.А. Идентификация пород и популяций медоносной пчелы с использованием метода ПЦР // Сельскохозяйственная биология. 2010. № 6. С .26-29.
• Калашников А.Е., Кривцов Н.И., Бородачев А.В., Малькова С.А., Удина И.Г. Дифференциация отечественных пород пчел по микросателлитным локусам // Наука Кубани. 2011. (в печати).
• Estoup A., Garnery L., Solignac M., Cornuet J.M. Microsatellite variation in honey bee (Apis mellifera L.) populations: hierarchical genetic structure and test of the infinite allele and stepwise mutation models // Genetics. 1995. V.140. P. 679-695.
• Nei M., Tajima F., Tateno Y. Accurary of estimated phylogenetic trees from molecular data // J. Mol. Evol. 1983. N 19. P. 133-170.

Калашников А.Е.1, Кривцов Н.И.2, Бородачев А.В.2, Малькова С.А 3, Удина И.Г.1

• Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва
• ГНУ НИИ пчеловодства РАСХН, г. Рыбное
• ФГУП племенное пчелоразведенческое хозяйство «Майкопское», г. Майкоп